大腸機能と大腸細菌の話
私たちの研究室では，大腸の細菌の生態や細菌が腸管の運動などの生理に与える影響について研究しています．この研究には，おもにブタを使っています．今，ベイブと同じランドレース種の成メスブタを数匹を飼ってますが，太らせて食べるために飼っているわけではありません．彼女たちの大腸の中身を頂戴して，そこに棲みついている細菌の研究をするためです．どうして，ブタかといえば，じつは彼らの大腸に棲みついている細菌は人間のものとよく似ているからです(39)．彼女たちのおなかには人工肛門によく似た仕組みの装置が取り付けてあるので，殺さなくても大腸の中身が採取できるのです．また，ブタの消化器は，運動の神経支配のやり方などがヒトと同じであったり，糞便塊の形成過程がヒトとかなり類似していること，体重や臓器の大きさがヒトと同じ水準であることなど，この種の実験を行う際に，ラットやマウスなどと比べて有利な点が多くあります．なによりも日本でも大量に生産されている食用家畜ですので，実験動物としての入手の容易さや遺伝的要素の均一性で，医学用の実験動物であるイヌよりもはるかにすぐれています．
ブタの飼育すなわち養豚は、集約化が進められきわめて早期の離乳が常識となっています。しかし、この飼育形態は抗生物質の使用が前提となっており、抗生物質抜きでは生産性を維持することができません。しかし、家畜飼料用抗生物質の使用は、とくに抗生物質耐性菌(18)の発生の原因であるとされ使用が制限される方向にあります。抗生物質に代わる手段の開発が産業としての畜産を維持するために必須であると考えられています。そのため、ブタを用いた研究をおこなっています。(39,40)
ことに、以下に示すような大腸内容物をとりだして培養実験をおこなう際に、内容物がたくさんとれることは実験技術上きわめて重要なことですし、ラットではいちいち殺さないといけないからです。
乳酸からの酪酸生成の重要性と乳酸利用菌の利用
大腸の細菌は，そこにやってくる餌の残骸や粘液などにたいして発酵作用を及ぼし，有機酸とガスを作っています．たとえば小腸で消化吸収されにくい繊維質は大腸までやってきて発酵されます．酢酸，プロピオン酸，酪酸・二酸化炭素・メタンガスがおもに作られます．これらの酸は大腸の粘膜から吸収され，酢酸とプロピオン酸は肝臓に送られます．酪酸は大腸の粘膜上皮細胞のエネルギー源としてそこで消費されます．大腸では，反すう胃と同じような微生物生態系が発達し，動物へのエネルギー供給の一助となっています．いま，腸内環境を変化させるものがいろいろと商品化されていますが，そうしたものが細菌叢にどのような変化を与え，さらに大腸の生理にどのような影響を与えるのかということについて研究しているところです(10,13,14,15,19,22,30,35,44,45,47)．いろいろな商品がある関係で乳酸菌やビフィズス菌の効用がよく強調されています．でも，評価が必ずしも定まっているわけではないのでその点についても興味を持っています．とくに乳酸やコハク酸がたくさん発生すると下痢がおこったりしていろいろな不都合が生じるので(20,24,29)，そうさせないためにはどうすればよいのかというような研究をしています(25,30,32)．その結果、乳酸の蓄積を除去するために乳酸利用菌をプロバイオティックスとして利用することを提案しました(25,32,)
プロバイオティック乳酸菌の効果
わたしたちの最近の研究で、乳酸菌を投与すると腸内にもともとすんでいた常在の乳酸菌がその数を増し、また検出される種類も増えることを明らかにしました(14)。いわゆるプロバイオティックス乳酸菌の場合には、腸管に定着することはできないとされています。ヨーグルトなどで使用されるものの多くはそもそも腸管由来ではないためですし、かりにヒト腸管由来でも、すでに腸管に定着しているその人固有の乳酸菌をおしのけて定着することは極めて起こりにくいからです。むしろ、腸管を通過する際に発酵作用を及ぼし、その際にその細菌特有の物質を生産し、そのことでもともとそこに棲んでいる細菌に影響を及ぼすことで、最終的にヒトに作用する側面を持っていると想像されていました。ですから、私たちの研究で明らかにできたことは、こうした作用機序がじっさいに働いているのだということです(27,37,38,41,42)。
いっぽう、こうしたプロバイオティックスの効果は必ずしもすべてのヒトや家畜で顕著にあらわれるわけではありません。個体差も大きいということがいわれます。その理由の一つは、腸内菌の組成には著しい個体差があることだと考えられています。個人に特有の腸内細菌の構成は、遺伝的要素によって決定される部分があるとされています。そこで、親子間、子供間でフローラ構成菌種の類似性を分子生物学的手法で調べています(17,31,36,39,43)。こうした研究によって、効果に個人差がある理由のひとつを解明しようとしています(37,38)。
プレバイオティックス
また、プロバイオティック効果を持った腸内細菌を増加させる能力を持った食餌成分、サプリメントであるいわゆるプレバイオティックスの効果について大腸粘膜を中心に組織化学的に検討しています。フラクトオリゴ糖を子豚に与えると、大腸で発生する酪酸の濃度が増加し、その結果粘膜上皮組織が肥厚することがわかりました(19,33)。粘膜が丈夫になるといえます。腸管粘膜の傷害に対する予防効果がみこまれます。これとの関係で大腸の粘膜の状態は食べる糖質と大腸で発生する有機酸のパターンによって変化することを示しました（28）。
こうしたプロバイオティックスの効果は、これまでビフィズス菌や乳酸菌が腸内で増殖すると有害物質を発生する細菌を阻害するというメカニズムで説明されてきました。しかし、ビフィズス菌や乳酸菌の主生成物である乳酸は、過剰に蓄積すると粘膜の障害を起こし上記のように下痢の発生とも深く結びついています。また改善効果が認められたとされるプロバイオティックスの実験では、多くの場合で酪酸の有意な生成増加がみとめられており、増加した乳酸菌（ビフィズス菌もふくむ）のつくった乳酸を酪酸に転化する細菌が優勢化した可能性があるとおもわれました。われわれの研究では、乳酸菌とともに乳酸利用菌Megasphaera elsdeniiが優勢菌として単離されており、この推論が支持されました(23)。そこで、Megasphaera elsdeniiをプロバイオティックとして使い過剰な乳酸を消失させることに成功しました(25,32,49)。
また、食べた乳酸菌の大腸における濃度が食後数時間後に上昇し、その後もとの低いレベルにもどることを確かめ、ここからある一定以上の投与菌の濃度を維持するためには、比較的頻繁な接種が必要であることを示しました(37)。
また，食餌性の含硫アミノ酸や粘膜上皮から分泌される粘液にふくまれる含硫多糖は，硫化水素(H2S)やメタンチオール(CH3SH)発生の基質になります．これらのものから揮発性硫化物を発生させる細菌について研究するとともに、こうした大腸粘膜を傷害するおそれのある有害な物質の発生を制御する方法を検討しています。そのためシソ科を中心としたいくつかの植物の抽出物を調整し、これを動物にあたえるとそれが大腸ではたらき硫化水素やメタンチオールの発生を抑制することを明らかにしました(12,15,16,22)。
大腸の機能障害のひとつである下痢の発生時にその原因によって便中の有機酸含量が大きく異なることを見いだしました。すなわち、ブタなどでみられる過食性消化不良で起こる下痢の場合には乳酸が、抗生物質の処方でおこる抗生物質起因性下痢の場合には、乳酸に加えてコハク酸が異常に蓄積するという特徴があり、これに対して病原性大腸菌症にともなう下痢ではこのような有機酸の異常な蓄積は認められないことを見いだしました(20)。抗生物質起因性下痢の際には、通常では優勢にならない抗生物質耐性の細菌が選択され、腸球菌、乳酸菌、大腸菌などだけで腸内フローラが構成されてしまいます。このうちの大腸菌はコハク酸を大量に発生することを明らかにし、コハク酸異常蓄積の原因菌と判断しました(9,24)。
大腸ガンの予防
酪酸を増強できるプレバイティックスをあたえつづけることでネズミの実験系で大腸の発ガンを予防できることがわかりました(35)。組織学的な評価をすると異常な上皮細胞にアポトーシスを誘導する力が関係しているのではないかということが示唆されました。特定の遺伝子の発現状態も変化しており、アポトーシスの入り口に当たる遺伝子の発現増強も示唆されました(47)。
抗生物質耐性菌
ブタ糞便よりバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)を日本ではじめて単離し、この事実を2001年7月開催の国際腸内細菌学会で発表しました(18)。また、その内容を論文として公表しました(34)。VREのニワトリへの伝染を乳酸菌製剤で制御する方法について成果を得ました。(46,50)
関連する研究発表
(1) Ushida K, Ohashi Y, Miyazaki K, and Kojima Y.(1995)
Sulphate reduction and methanogenesis in the ovine rumen and porcine caecum: A comparison of two microbial ecosystems. Deutsche Tierarzliche Wochenscrift 102 (5): p.154- p.156（1995）
(2) Ushida K. and Sakata T. (1998)
Effect of pH on Oligosaccharides fermentation by porcine cecal digesta Anim.Sci.Technol. 69(2) : p.20-p.27.
(3) Ushida K, Fukusada Y, and Kojima Y. (1998)
Effect of pH on Dissimilatory Sulfate Reduction by Porcine Cecal Microflora.Anim Sci Technol. 69(6) : p.571-p.575.
(4) 石川佳美・牛田一成・荒川勉（1998）
「植物抽出物による大腸内揮発性硫黄化合物生成の抑制」Hindgut Club Japan 第4回ミーティング P8
(5) 牛田一成・石川佳美・大島尚子・小島洋一・高桑進（1998）
「メチオニンから揮発性硫化物を生成する腸内細菌の検索」Hindgut Club Japan 第4回ミーティング P9
(6) 塚原隆充・東ゆかり・牛田一成・竹内一之（1998）
「ブタモデルにおける抗生物質投与による下痢とコハク酸の異常蓄積」Hindgut Club Japan 第4回ミーティング P10
(7) Sakata T, Kojima T, Fujieda M, Miyakozawa M, Takahashi M, Ushida K (1999)
Probiotic preparations dose-dependently increase net production rates of organic acids and decrease that of ammonia by pig cecal bacteria in batch culture. Dis Dig Sci 44, 1485-1493.
(8) 塚原隆充・東ゆかり・牛田一成(1999)
「抗生物質投与にゆらいする下痢(AAD)とコハク酸の異常蓄積の原因菌」Hindgut Club Japan 第5回ミーティング P13
(9) Tsukahara T. and Ushida K. (2000)
Succinate accumulation in pig large intestine during the antibiotic associated diarrhea (AAD) and isolation of succinate producing bacteria. Reproduction Nutrition Development 40 (2) 213.
(10) Tsukahara T, Azuma Y, Takeuchi K and Ushida K. (2000)
The effect of combinative-dispensation of probiotic and digestive enzyme for the digestion and large-bowel fermentation in weaning piglets. Chonai Saikingaku Zasshi 14(1) 1-9.
(11) Tsukahara T. and Ushida K. (2000)
Effects of animal or plant protein diets on cecal fermentation in guinea pigs (Cavia porcellus), rats (Rattus norvegicus) and chicks (Gallus gallus domesticus) Comparative Biochemistry and Physiology A 127, 139-146
(12) Arakawa T, Ishikawa Y, and Ushida K (2000)
Volatile Sulfur Production by Pig Cecal Bacteria in Batch Culture and Screening Inhibitors of Sulfate Reducing Bacteria. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 46, 159-164.
(13) Tsukahara T., Azuma Y. and Ushida K. (2001) The effect of a mixture of live lactic acid bacteria on
intestinal gas production of pig Microbial Ecology in Health and Disease 13: 105-110.
(14) Ohashi Y, Inoue R, Tanaka K, Matsuki T, Umesaki Y. and Ushida K. (2001)
Lactobacillus casei strain Shirota-fermented milk stimulates indigenous Lactobacilli in the pig intestine
Journal of Nutritional Science and Vitaminology 47: 172-176.
(15) Yoshimi Ishikawa, Makiko Maekawa, Tsutomu Arakawa and Kazunari Ushida (2001)
Volatile sulfur production in large intestine as affected by the plant extracts in pig in vitro model
BIOSCIENCE and MICROFLORA 20: 49-52.
(16) Kazunari USHIDA,Naoko OSHIMA, Atsushi TANIMURA,Kohji MIYAZAKI, Yoichi KOJIMA, and Susumu TAKAKUWA (2001) Evaluation of methanethiol and hydrogen sulfide production by standard strains of intestinal bacteria and isolates from pig feces. BIOSCIENCE and MICROFLORA 20: 53-57
(17) Inoue R., Yamaoka R., and Ushida K.(2001) The diversity of the intestinal flora within a family. International Congress of Intestinal Bacteriology(ICIB 2001) Abstract p66. B-05
(18) Sakai Y., Iwasaki, Y. and Ushida K. (2001) Isolation of Vancomycin-resistant enterococcus from pigs in Japan. International Congress of Intestinal Bacteriology(ICIB 2001) Abstract p38
(19) Tsukahara T, Iwasaki Y., Nakayama K. and Ushid K. (2001) Enhancement of butyrate production in the large intestine of piglets by the dietary fructooligosahharides and its inflence on the mucosa. International Congress of Intestinal Bacteriology(ICIB 2001) Abstract p118.
(20) Tsukahara, T and Ushida K. (2001)
Organic acid profiles in feces of pigs either with pathogenic or non-pathogenic diarrhea.
Journal of Veterinary Medical Science 63(12) 1351-1354.
(21) Ohashi Y, Inoue R, Tanaka K, Umesaki Y. and Ushida K. (2001) Strain gauge force transducer and its application in a pig model to evaluate the effect of probiotic on colonic motility.
Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 47,351-356.
(22) Ushida,K., Maekawa, M. and Arakawa, T. (2002) Influence of Dietary Supplementation of Herb Extracts on Volatile Sulfur Production in Pig Large Intestine. Journal of Nutritional Science and Vitaminology 48(1):18-23.
(23) Tsukahara T, Koyama, K. Okada, A. and Ushida, K. (2002) Stimulation of butyrate production by gluconic acid in the pig large intestine, and identification of butyrate producing bacteria.
Journal of Nutrition, 132, 2229-2234.
(24)Tsukahara, T and Ushida, K. Succinate accumulation in pig large intestine during antibiotic-associated diarrhea and the constitution of succinate-producing flora. Journal of General and Applied Microbiology 48, 143-154.
(25)Ushida,K., Hashizume, K., Tsukahara, T., Yamada, K., and Koyama, K.(2002) Megasphaera elsdenii JCM1772T regulates hyper lactate production in the rat large intestine. Reproduction, Nutrition Development 42 (Suppl.1): S56-57.
(26)Inoue, R. and Ushida, K.(2002) Factors affecting intestinal flora construction in infant rat. Reproduction, Nutrition Development 42 (Suppl.1): S19.
(27)Ohashi, Y., Inoue,R. and Ushida,K.(2002) Transition of probiotic bacteria, Lactobacillus casei strain Shirota, in gastrointestine of pig. Reproduction, Nutrition Development 42 (Suppl.1): S21-22.
(28)Tsukahara T, Iwasaki Y, Nakayama K, Ushida K. 2002. An improved technique for the histological evaluation of the mucus-secreting status in rat cecum Journal Nutritional Science and Vitaminol 48,311-314.
(29) Tsukahara T, Iwasaki Y, Nakayama K, and Ushida, K. (2003) Microscopic structure of the hindgut mucosa in the piglets during the antibiotic-associated diarrhea. Journal of Veterinary Medical Science 65, 301-306.
(30)Ushida K, Hoshi S, and Ajisaka K (2003) 13C-NMR studies on lactate metabolism in a porcine gut microbial ecosystem. Microbial Ecology in Health and Disease 14: 241-246.
(31) Inoue, R. and Ushida K.(2003) Development of the intestinal microbiota in rats and its possible interactions with the evolution of the luminal IgA in the intestine. FEMS Microbiology Ecology, in press.
(32) Hashizume, K., Tsukahara, T., Yamada, K., Koyama, H., and Ushida, K. (2003) Megasphaera elsdenii JCM1772T normalizes hyper-lactate production in stimulating butyrate production in rat large intestine. Journal of Nutrition, 133(10), 3187-3190.
(33)Tsukahara T, Iwasaki Y, Nakayama K, Ushida K. 2003.
Stimulation of butyrate production in the large intestine of weaning piglets by dietary fructooligosaccharides and its influence on the histological variables of the large intestinal mucosa.
J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2003 Dec;49(6):414-21.
(34) Sakai, Y., Tsukahara, T., and Ushida K. 2003. Isolation of Vancomycin resistant Enterococci from piglets of an avoparcin-free pig farm in Japan and its multiple resistance. AnimalScience Journal 74 (6) 521-523.
(35)Kameue,C., Tsukahara, T., Yamada, K., Koyama, H., Iwasaki, Y., Nakayama, K. and Ushida K. 2004. Dietary sodium gluconate protects rats from large bowel cancer by stimulating butyrate production. Journal of Nutrition 134(4):940-944.
(36)Inoue, R. and Ushida K.(2003) The vertical and horizontal transmission of the intestinal commensal bacteria in the rat model. FEMS Microbiology Ecology46(2), 213-219
(37) Ohashi Y., Umesaki, Y. and Ushida K. (2004) Transition of the probiotic bacteria, Lactobacillus casei Shirota, in the gastrointestinal tract of a pig. International Journal of Food Microbiology, 96, 61-66.
(38)Ohashi Y., Tokunaga,M. and Ushida K. (2004) The effect of Lactobacillus casei strain Shirota on the cecal fermentation pattern depends on the individual cecal microflora in pigs. Journal of Nutritional Science and Vitaminology 50,399-403
(39)Ryo Inoue, Takamitsu Tsukahara, Nobuo Nakanishi and Kazunari Ushida (2005) Development of the intestinal microbiota in the piglet. Journal of General and Applied Microbiology 51(4),257-265
(40)Takamitsu TSUKAHARA, Nobuo NAKANISHI, Keizo NAKAYAMA, Noritaka MATSUBARA and Kazunari USHIDA (2005) Experimental Infection of Enterotoxemic Escherichia coli Associated with Porcine Edema Disease and its Pathologic Characteristics in the Intestine Journal of Veterinary Medical Science67, 1169-1173
(41)TAKAMITSU TSUKAHARA1,2*, WAKOTO BUKAWA3, TATSUHIKO KAN3 & KAZUNARI USHIDA1(2005) Effect of a cell preparation of Enterococcus faecalis strain EC-12 on digesta flow and recovery from constipation in a pig model and human subjects Microbial Ecology in Health and Disease 17(2), 107-113
(42)Yuji Ohashi, Kanako Nagai, Makoto Tokunaga, Kazunari Ushida, and Tomomi Yamada (2005) Stimulation of Cytokine Gene Expression in a Murine Macrophage Cell line by Lactic acid bacteria isolated from Bhutanese dried Yak Cheese. Bioscience and Microflora 24(4): 125-128
(43) Ryo Inoue, Mai Otsuka and Kazunari Ushida (2005) Development of intestinal microbiota in mice and its possible interaction with the evolution of luminal IgA in the intestine. Experimental Animal 54(5) 437-445
(44)MAKIKO MAEKAWA,KAZUNARI USHIDA, SEIKO HOSHI ,NAOKO KASHIMA,KATSUMI AJISAKA & TAKAJI YAJIMA (2005) Butyrate and propionate production from D-mannitol in the large intestine of pig and rat Microbial Ecology in Health and Disease 17:169-176
(45) Kazunari Ushida, Shiho Fujita and Gaku Ohashi (2005) Nutritional significance of the selective ingestion of Albizia zygia gum exudate by wild chimpanzees in Bossou, Guinea . American Journal of Primatology 68( 2 ), 143 - 151
(46) Y. Sakai, T. Tsukahara, W. Bukawa, N. Matsubara, and K. Ushida 2006 Cell Preparation of Enterococcus faecalis Strain EC-12 Prevents Vancomycin-Resistant Enterococci Colonization in the Cecum of Newly Hatched Chicks. Poultry Science 85:273-277
(47) Chiyoko Kameue, Takamitsu Tsukahara, and Kazunari Ushida (2006) Alteration of Gene Expression in the Colon of Colorectal Cancer Model Rat by Dietary Sodium Gluconate. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 70(3)606-614
(48)Akio Kishimoto, Kazunari Ushida, Glyn O. Phillips,Takashi Ogasawara, Yasushi Sasaki (2006) Identification of Intestinal Bacteria Responsible for Fermentation of Gum arabic in pig model. Current Microbiology in press
(49)Takamitsu TSUKAHARA, Kenta HASHIZUME, Hironari KOYAMA, Kazunari USHIDA(2006) Stimulation of butyrate production through the metabolic interaction between lactic acid bacteria, Lactobacillus acidophilus, and lactic acid utilizing bacteria, Megasphaera elsdenii in the pig cecal digesta Animal Science Journal in press
(50)Sakai, Y., Tsukahara, T., Matsubara, N. and Ushida, K (2006) The possibility of vancomycin-resistant enterococci (VRE) transmission from human to broiler, and the advantage to use the vancomycin-resistant gram-positive cocci as a model for screening study to prevent the VRE infection in the broiler chick. Animal Science Journal in press
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